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多能干细胞

评论2021-02-22来源:严选细胞网

什么是多能干细胞

多能干细胞(Stem Cells)是一类具有自我更新、自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下,它可以分化成多种APSC多能细胞,多能干细胞(Ps)具有分化出多种细胞组织的潜能,但失去了发育成完整个体的能力,发育潜能受到一定的限制。 

多能干细胞


多能干细胞简介

多能干细胞(Pluripotent stem cell,Ps)是当前干细胞研究的热点和焦点。它可以分化成体内所有的细胞,进而形成身体的所有组织和器官。因此,多能干细胞的研究不仅具有重要的理论意义,而且在器官再生、修复和疾病治疗方面极具应用价值。但是过去认为多能干细胞只能从人胚胎中获得。 

多能干细胞(pluripotent stem cell),具有分化出多种细胞组织的潜能,但失去了发育成完整个体的能力,发育潜能受到一定的限制。骨髓多能造血干细胞是典型的例子,它可分化出至少十二种血细胞,但不能分化出造血系统以外的其它细胞。 2009年6月3日中国科学家肖磊领导的科研小组首次从猪的体细胞中培育出多能干细胞,这也是世界上首次提取出家养有蹄类动物的多能干细胞。 

多能干细胞具有无限增殖和分化为所有三胚层细胞的能力,这两个特点使其成为各种疾病和损伤的细胞治疗的非常好的细胞来源。多能干细胞已经被开发并应用于临床研究治疗多种疾病和损伤,如帕金森,脊髓损伤,年龄相关黄斑变性,1型糖尿病等。为了让更多的病人能够从多能干细胞技术中获益,有许多的挑战需要广大的科学家来面对和解决。


多能干细胞的来源

多能干细胞的简单获得人类多能性干细胞系的建立有两个来源,其方法与以往在动物模型中建立的方法相同。 

(1) 在Dr. Thomson进行的工作中,他从人类胚胎的囊胚期内细胞群中直接分离多能干细胞。Dr. Thomson从IVF(体外受精)临床实验室得到胚胎,这些胚胎是不育症临床治疗不需要的,用于繁殖,而非研究目的。从捐献者夫妇处获得知情同意书后,Dr. Thomson分离了内细胞群,将这些细胞进行培养,产生一个多能性干细胞系。 

(2) 与此相反,Dr. Gearheart从终止妊娠的胎儿组织中分离出多能性干细胞。捐献者自行决定了终止妊娠,从他们那儿获得了知情同意书后,Dr. Gearheart从原本要发育成睾丸或卵巢的胎儿部位取得细胞。尽管Dr. Thomson 实验室和Dr. Gearheart实验室使用的细胞系来源不同,但发育成熟的细胞看起来非常相似。 

体细胞核转移(SCNT)是得到多能性干细胞的另一种途径。在SCNT的动物研究中,研究者将一个正常的动物卵细胞去除细胞核(含染色体的细胞结构)。存留在卵细胞内的物质含营养成分和对胚胎发育非常重要的能量物质。而后,在非常精细调控的实验室条件下,将单个体细胞--除卵细胞或精子细胞之外的任一种细胞--与除去核卵细胞放在一起,使两者相融合。融合细胞以及其子细胞具有发育成一个完整个体的潜能,因此是全能性的。正如图I所示,这些全能性细胞不久将形成胚囊,从理论上来说,可利用胚囊的内细胞群来建立多能性干细胞系。实际上,任何一种可生成人类胚囊细胞的方法都有可能成为人体多能性干细胞的来源。

 多能干细胞


多能干细胞的特性

致瘤性 (Tumorigenicity)

多能干细胞的一个重要优点是它具有无限的增殖潜力,因此我们可以制备数十亿的细胞量及不同细胞类型的供细胞移植。然而,这种特性同时是一把双刃剑,因为如果细胞在移植后继续增殖,就可能导致肿瘤产生。三种可能致瘤情况如下: 

第一,畸胎瘤的形成是hPSC细胞移植最严重的问题。如果未分化和/或未成熟细胞残留在已分化的最终细胞产物中,即使是少数残留的PSCs也可能导致畸胎瘤的形成。此外,如果移植体内存在特异性分化的干细胞,它们可能由于不正确或不完整的分化而形成肿瘤;如在体内神经系统会产生一种高度增殖的细胞。因此,发展高效定向细胞分化方法或利用细胞分选,获得高纯度、具安全性的功能性细胞供细胞移植,以防止畸胎瘤和其他肿瘤产生。Masayo Takahashi及其团队在首次临床移植工作中获得了>95% hiPSC来源的视网膜色素上皮细胞 (RPE)用于老年黄斑变性患者移植。此外, 甚至需要更严格的细胞纯化程序来达到临床试验的安全标准。Jun Takahashi与其团队使用符合GMP等级的细胞分选仪(MACSQuant® Tyto® ),利用Corin抗体分选多巴胺能神经前体细胞,进行帕金森氏症细胞移植临床试验。 

第二,如果iPSC细胞中的重编程因子仍然活跃,它们也可能会促进肿瘤的发生。这种风险是iPSC特有的。常用的四种重编程因子(Oct4, Sox2, Klf4 & c-Myc) 都与肿瘤发生有关,尤其是c-Myc,它是人类癌症中最常发生突变的基因之一。经证明通过逆转录病毒介导的四种重编程因子的转染而产生的iPSCs嵌合小鼠通常会发生肿瘤,主要是来自于c-Myc逆转录病毒的再激活。另外,在使用质粒产生的iPSCs中,EBNA1用于维持重编程因子的游离型表达 (episomal expression) 亦有致癌风险。因此,在临床细胞治疗中应该谨慎地排除这些致癌的转基因在hiPSC中的不当激活表现。 

第三,致瘤性可能是由PSC体外培养过程中发生的基因突变引起的。这种风险对于任何细胞移植前需体外扩增的都很常见。体外扩增细胞的培养不可避免地会引起基因改变,如染色体异常、基因拷贝数变异和单核苷酸突变。传统上,染色体异常可通过核型分析来监测,一但发现染色体缺失、重复或重排等异常细胞及被排除不用于细胞治疗和其下游应用。在hESCs和hiPSCs中,染色体1号、12号、17号和20号在长期扩增后常出现重复。具有这种染色体异常的PSC细胞系即不适用于细胞治疗。 

多能干细胞

免疫原性 (Immunogenicity)

免疫排斥反应是细胞治疗的另一个关键问题。由患者自身细胞产生的iPSCs提供了前所未有的机会进行自体移植 (autologous transplantation) 以规避免疫反应。然而,自体iPSCs的免疫原性仍存在争议,归因于潜在的异常基因表达。最近研究发现,线粒体的新突变 (de novo mutations) 被认为是自体iPSCs新表位抗原 (neoepitopes)的潜在来源。 

目前考虑到生产成本(经费与时间),同种异体移植 (allograft) 仍是优于自体移植。在严重或急性的适应症中,包括心力衰竭和脊髓损伤,生产临床级自体细胞产品的时间过长将不利于这些急性疾病的治疗。传统上,移植排斥反应是通过免疫抑制剂来克服的。另一种减少排斥反应的方法是HLA单倍型匹配,这是目前广泛应用于造血干细胞移植的方法。数百万捐献者在世界各地的骨髓库中登记在册。脐带血样本也可用于患有白血病和其他血液疾病的患者。然而,用数千种独特的HLA单倍型制备hPSC系是不现实的。相反地,借助iPSC技术,普遍建议从捐赠者中选择HLA-a、HLA-B和HLA-DR匹配的供体生产iPSC细胞株,建立储备随时可应用于细胞分化与移植。 

HLA纯合供体的优势。10个个体的HLA单倍型以不同的颜色组合显示(上)。它们没有一个完全相同或理想的组合。来自一个HLA纯合供体的iPSC线显示在下面板中,10个人中有4个提供HLA匹配。 

最近,随着基因编辑技术,特别是CRISPR/Cas9,出现了另一种方法:使HLA基因在多能干细胞中失活。所有的I类MHC,包括HLA-A、HLA-B和HLA-C,可通过删除其共同成分基因(B2M)而失活。同样,HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR的表达可通过删除对II类MHC基因转录激活因子来抑制,包括CIITA。这种方法被称为HLA掩蔽 (HLA Cloaking)。 

降低同种异体移植免疫原性的两种方法。(A) 通用细胞。所有I类MHC分子均因B2M基因缺失而失活。将HLA-E/B2M融合转基因导入B2M-null-iPSC,以防止内源性NK细胞的细胞毒性。(B) HLA纯合及HLA-C-only iPSC株系。少数HLA纯合iPSC株可以覆盖大量人群。去除HLA-A和HLA-B,仅保留HLA-C,将覆盖更广泛的人群。此外,HLA-C将在抵御肿瘤和病毒中发挥作用。 

HLA Cloaking的最大优点是仅许少量细胞株即可覆盖全世界人口。一个单一的hiPSC株系有可能成为一种通用的细胞来源;因此在生产细胞供治疗极具吸引力。首先,它具有成本效益;目前生产GMP级的hESC或hiPSC细胞株至少需要花费20万美元。此外,监管部门将要求对每一个细胞株进行严格的临床前数据。 

异质性 (Heterogeneity)

多能干细胞具有两个特性:多能性和无限增殖。然而,每个PSC细胞株并不完全相同。每一个细胞株在细胞形态、生长曲线、基因表达和分化为不同功能细胞的潜力上都是不同的。这种“异质性”是包括细胞疗法在内,多能干细胞下游应用的障碍。 

早期的比较有限数量的hESC和hiPSC系的研究表明,两个hPSC系在基因表达、表观遗传状态和分化潜能方面存在显著差异。然而,后来的研究使用了更多的样本数来反驳早期的研究研究。Hochedlinger及其团队一项研究表明,基因匹配的hESC和hiPSC是无法区分的。遗传背景是决定基因表达异质性的最大因素。 

为了克服异质性,一些研究人员试图将hPSCs的“primed”状态转换为“naïve”状态。hPSCs可以通过转化为“naïve”状态来增强其分化能力。然而对于naïve hPSCs的一个担忧是遗传完整性 (genetic integrity) 。另一个是遗传印记的丢失 (loss of imprinting) 。这些都会阻碍naïve hPSCs的临床应用。 


多能干细胞的潜在应用

有诸多理由可说明多能干细胞对科学和人类健康的进展的重要性。最基本的,多能干细胞可以帮助我们理解人类发育过程中的复杂事件。该项工作的首要目标是,确定参与导致细胞特化的决定因素。虽然我们已知基因的启动和关闭是该进程的核心,但我们对这些"决定"基因以及使之启动或关闭的因素知之甚少。人类最严重的医学难题,如癌症和先天缺陷就是因异常的细胞特化和细胞分化所导致。如果能更好地了解正常细胞的分化发育过程,从而能更深刻地理解其中的基本错误,了解这些致死疾病的成因。 人体多能干细胞研究也能大大地改变研制药品和进行安全性实验的方法。例如,新的药物/治疗方法可以先用人类细胞系进行实验,如癌细胞系就是为了这种实验而建立的。多能干细胞则使更多类型的细胞实验成为可能。这不会取代在整个动物和人体身上进行实验,但这会使药品研制的过程更为有效。只有当细胞系实验表明药品是安全的,并有好的效果时,才有资格在实验室进行动物和人体的进一步实验。 也许人体多能干细胞最为深远的潜在用途是生产细胞和组织,它们可用于所谓的"细胞疗法"。许多疾病及功能失调往往是由于细胞功能障碍或组织破坏所致。如今,一些捐赠的器官和组织常常用以取代生病的或遭破坏的组织。遗憾的是,受这些疾病折磨的病人数量远远超过了可供移植的器官数量。多能干细胞经刺激后可发展为特化的细胞,使替代细胞和组织来源的更新成为可能,从而可用于治疗无数的疾病、身体不适状况和残疾,包括帕金森氏病、Alzheimer’s病(痴呆症)、脊髓损伤、中风、烧伤、心脏病、糖尿病、骨关节炎和类风湿性关节炎。




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