血管内皮干细胞

血管内皮干细胞是什么

血管内皮干细胞是生成血管的源头，是一种在自身增加的同时可以大量生成血管内皮细胞的特殊干细胞。

血管内皮干细胞的功能

血管内皮干细胞可以新生血管内皮细胞,恢复血管功能。新生的血管内皮细胞还可以产生足量的一氧化氮、前列环素2等多种活性物质,发挥抗动脉粥样硬化、抗血栓的功能。还可以新生血管平滑肌细胞，预防和治疗动脉硬化，恢复血管的顺应性，增强血管功能。

血管内皮干细胞的培养方法

血管内皮干细胞的培养包括以下步骤：

一、先制备血管内皮干细胞。

1、选取优质脐带，检测传染病源，传染五项指标均为阴性，则此脐带可进行下一步实验；2、分离血管内皮干细胞，包括以下步骤：

（1）带无菌手套，取出脐带，在止血钳内侧用碘酒和酒精棉球消毒后，用无菌剪刀将两端脐带剪除；

（2）在脐带的一端找到静脉，插入脐带静脉插管，用两根粗丝线扎牢，并冲洗静脉腔，至将脐血洗净；

（3）赶出所述静脉腔内的残余液体，将脐带的另一端用止血钳夹闭，用IOml注射器连接针头，注入37°C预热的0.1%胶原酶约6-8ml，放入37°CCordBuffer中保温6-10min;

（4）吸出静脉腔内胶原酶所消化的细胞悬液，加入预加有20mlcordBuffer的离心管中，再冲洗静脉腔，一并加入离心管中；

（5）离心，1500rpm，IOmin，弃上清液，收集细胞；

3、配制培养液；

4、培养液重悬细胞；

二、将第一步中分离的血管内皮干细胞进行培养。

1、培养血管内皮干细胞，通过充入氮气，调整O2浓度为5%、20%，CO2浓度设置为5%，将重悬的细胞进行培养;每隔3天换液，直至细胞长至80-90%;

2、细胞消化传代，步骤b所得细胞，PBS洗涤两遍后，加入消化液，放入37度培养箱消化Imin，培养液重悬细胞，进行分瓶传代培养；

三、将第二步中获得细胞铺板进行增殖曲线实验。

取血管内皮干细胞，以IXlO3个/孔接种于六块6孔板，每两块板为一组，每板接种4孔;其中第一组置于5%CO2的条件下，第二组置于5%O2、5%CO2的条件下、第三组置于20%O2、5%CO2的条件下分别培养;培养24h后，将各板的第一孔进行消化，收集细胞，进行计数；同样，培养48h、72h、96h后分别进行同样操作，绘制增殖曲线；

四、将第二步中获得细胞收集进行流式检测鉴定干细胞。

收集P9代细胞，离心并再悬浮于IXPBS，于细胞计数仪上计数;细胞与⑶45、CD34孵育；所有抗体均直接标记;培育后，收集细胞，离心并重悬于IXPBS，立即采用流式细胞仪检测。

血管内皮干细胞的检测方法

1、根据标记分子检测

根据血管内皮前体细胞的表面标志，可将其与成熟内皮细胞相区分。一部分CD34+细胞能分化为内皮细胞，但CD34不能作为区分血管内皮前体细胞与成熟内皮细胞的表面标志。中科博生。

血管内皮前体细胞与成熟的内皮细胞都具有一些相同的表面标志，包括CD34、KDR(即flk-1,又称VEGFR-2),Tie-1.Tie_2和VE-钙黏着蛋白(vascularendothelialcadherin),所以不能用这些标志来区分这两种细胞。从循环血中区分开这两种细胞更困难，因为造血干/祖细胞也具有上述表面标志。目前认为，内皮前体细胞区别于成熟内皮细胞的主要标志是CD133(即AC133)。

2、根据分化潜能检测

从功能上检测血管内皮干细胞可用体外分化实验和体内移植实验，看是否能分化为成熟内皮细胞。成熟内皮细胞的主要特征是，具有vW因子、CD31和KDR,释放一氧化氮，特异结合荆豆凝集素(UEA-1),摄取乙酰化低密度脂蛋白等。

根据这些特征已发展了许多方法对成熟内皮细胞进行鉴定，体内移植常用小鼠后肢缺血模型，通过将小鼠单侧后肢骨动脉结扎，检测移植细胞是否参与血管新生。

血管内皮干细胞增殖和分化能力在冻存情况下的影响

循环外周血中存在血管内皮细胞的前体细胞，即血管内皮干细胞（endothelialprogenitorcells,血管内皮干细胞），目前已对血管内皮干细胞进行了大量的研究。但是有关血管内皮干细胞的生物学特性、募集和分化等机制尚未完全清楚。本实验采用免疫磁珠技术分离人脐带血中的CD133+血管内皮干细胞，并进行冻存，通过复苏、体外培养，探讨冻存时间对血管内皮干细胞的分化、增殖能力的影响。

1、材料与方法

（1）脐血采集，征得本人及家属同意，选取40例足月行剖腹产的健康产妇，待剖腹手术取出胎盘后，即用含抗凝剂的无菌采血袋（华南医疗器械公司）采集胎盘端脐带血,采血量60-120ml,充分摇匀后待分离。

（2）细胞分离，将40例脐血予PBS液稀释，按加入0.5%甲基纤维素混匀，静置30min后吸取上清液。去上清，PBS重悬后，用Ficoll-Paque淋巴细胞分离液（美国,Amersham）按密度梯度离心法提取单核细胞;将其中20例获取的单核细胞采用磁珠分离试剂盒及MACS分选系统（德国，Miltenyi）提取CD133+细胞;另将107单核细胞及106CD133+细胞分别与FITC标记的抗体（德国，Miltenyi）孵育，送流式细胞仪检测脐血单核细胞及磁珠分选获取的CD133+细胞纯度。

（3）细胞冻存及复苏，将获得的20例单核细胞及20例CD133,细胞，用台盼蓝染色法进行活细胞百分比计数测定;将单核细胞和CD133*细胞分别按107个细胞/ml密度加入冻存液中,混匀后移至塑料冻存管中;按程序降温步骤冻存于液氮中:将冻存管置入4Y冰箱中30min,再转入-20X：冰箱60min,然后置入-70Y冰箱24h,最后转入液氮保存;在冻存至3,6,12,18个月时,每次分别各将冻存的5例单核细胞及5例CD133+细胞复苏;取少许细胞悬液用台盼蓝染色法进行活细胞百分比计数，其余细胞加入培养瓶中进行培养。

（4）血管内皮干细胞培养

用10pig/ml纤维连接蛋白（美国,Sigma）预处理好24孔培养板，将不同冻存时间的CD133+细胞按10）孔密度重悬于EBM-2培养液（美国.Clonetics）培养，置于5%C02持续通气、湿度95%、37七恒温培养箱培养;另将同样浓度CD133+细胞接种于纤维连接2蛋白预处理好的无菌盖玻片,置于6孔板内同样条件培养，作细胞免疫组化检验。均培养至第4天换液，以后每2天换液，培养7d后，计算每孔平均形成的梭形细胞集落数，各组间进行统计学比较。

（5)内皮细胞免疫组化鉴定将在6孔板内盖玻片上培养满1周的血管内皮干细胞细胞吸去培养液,PBS漂洗后，4%多聚甲醛固定细胞20min,60%-100%乙醇固定各5min,加入3%H2O2阻断15min.PBS漂洗，予小牛血清封闭10min,各取3孔分别滴加一抗:小鼠抗人单克隆抗体CD34（丹麦，Dako,浓度为1：50）及VDI因子（Dako,浓度为1：50）,置于4Y过夜；PBS漂洗后，按ChemMateTMEnVision试剂盒（美国,Dako）步骤进行两步法染色，苏木素复染，60%-100%乙醇漂洗各5min,二甲苯漂洗3次各5min,中性树胶封片后显微镜下观察，细胞胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性。将同样条件培养的人脐静脉内皮细胞（HUVEC,购自中山大学实验动物中心细胞库）作为对照，按上述步骤进行CD34及伽因子鉴定。显微镜下分别计算两者各3孔中CD34及VD1因子每100个细胞的平均阳性数。

（6）统计学方法使用SAS8.0软件进行统计分析，组间比较采用方差分析。

2、血管内皮干细胞的实验结果

(1)CD133+细胞数量及纯度经流式细胞仪检测密度梯度离心法获取的单核细胞中CD133+细胞平均百分比为（1.13±0.10）%;经免疫磁珠分选获取的CD133+细胞量平均为（9.01±0.60）x10七经流式细胞仪鉴定CD133,细胞平均纯度为（91.45±1.04）%。

(2)血管内皮干细胞体外培养特性磁珠分选获取的血管内皮干细胞细胞呈圆形，体积较小，培养24h内细胞贴壁生长，胞体逐渐伸展、变大。细胞在3d左右开始逐渐形成梭形。少部分细胞体积增大、胞体不规则，在培养5~7d,团状生长的梭形血管内皮细胞形成局部典型的集落，细胞团块中央为较大的圆形细胞，周边为梭形细胞围绕。

(3)细胞免疫组织化学检查予EBM-2培养1周的CD133+细胞及HUVEC,分别行细胞免疫组化检测CD34及VDI因子表达情况。结果大多数细胞均阳性表达CD34及vm因子，阳性颗粒分布于胞浆内，胞核未见分布。CD34阳性表达率在CD133+细胞组及HUVEC组分别为（95.83±2.23）%和（97.58土1.28）%,行t检验结果差异无显著性（P=0.1264）；VDI因子阳性表达率在CD133*细胞组及HUVEC组分别为（95.92±1.43）%和（97.08±1.02）%,行z检验结果差异无显著性（P=0.1347）。

(4)冻存对于血管内皮干细胞影响的比较冻存3,6,12,18个月的单核细胞和CD133'细胞复苏后，经台盼蓝染色测定活细胞百分比，结果示不同冻存时间对于两种细胞的活细胞百分比没有明显的影响（F=0.9565,P>0.05；F=0.9536,P>0.05）。

不同冻存时间的单核细胞和CD133+细胞复苏后,经体外培养，细胞生长形态与未经冻存的单核细胞和CD133+细胞相似，均可经培养形成梭形细胞集落；比较血管内皮干细胞各组形成梭形细胞集落的数量,结果示不同冻存时间对于血管内皮干细胞细胞集落形成数量有影响；两种细胞形成的梭形细胞经免疫组化证实为阳性表达CD34和VHI因子的内皮细胞。

血管内皮干细胞的获取途径

1、通过密度梯度离心法获取单核细胞,收获贴壁生长细胞。

2、结合免疫磁珠分选单核细胞中的血管内皮干细胞。获取高纯度的血管内皮干细胞主要依靠细胞表面标志进行免疫磁珠分选。CD133抗原是一相对分子量为120000的糖基化多肽。CD133表达于血管内皮干细胞,在分化过程中迅速下调而不表达于成熟内皮细胞。因此CD133为能排除成熟内皮细胞的血管内皮干细胞标记。通过釆用密度梯度离心法结合磁珠分选法获取脐带血中的血管内皮干细胞,经流式细胞仪鉴定获取细胞纯度较高，且步骤简单,操作过程短,对获取的细胞活性影响小。

血管内皮干细胞作为治疗动脉缺血性疾病的最有希望的治疗手段之一，目前已经进行了一些移植方面的研究。虽然脐血中的造血祖细胞的冻存已经有不少的研究，且血管内皮干细胞与造血祖细胞具有一些相同的标记物（如CD34、CD133）,但血管内皮干细胞与造血祖细胞在分化等生物学特性等仍有较大的差别，冻存对血管内皮干细胞的影响方面研究尚少，本研究通过将单核细胞及CD133+血管内皮干细胞冻存3~18个月后复苏，再进行体外培养，发现无论是单核细胞还是CD34+血管内皮干细胞,冻存时间对于两者的活细胞百分比均无显著影响，但是由结果可知冻存时间的延长对于CD133*血管内皮干细胞体外培养形成血管内皮细胞集落的能力有影响：集落形成能力随着冻存时间的延长而减弱，也就是说冻存时间的延长降低了血管内皮干细胞的增殖能力。这一结果与CD34+造血祖细胞的冻存相关研究结果有所不同。KOBYLKA等⑹将在液氮中保存了15年以上的脐血造血祖细胞解冻后，进行集落形成单位-粒细胞巨噬细胞（CFU-GM）培养，仍然获得成功。在临床方面也有文献报道E将在液氮中保存的外周血造血祖细胞在10年以后回输给患者仍可移植成功。

目前，可能冻存时间对于血管内皮干细胞的增殖、分化能力有影响，而相同的冻存条件对于CD34+造血祖细胞没有明显的影响，这说明虽然血管内皮干细胞和造血祖细胞表达相同的表面分子标记物（如CD34和CD133）、来源于同一种多分化潜能的祖细胞，但其向内皮系统分化的潜能可能较向血液系统分化的潜能更容易受冻存时间的影响,血管内皮干细胞较造血祖细胞更不适于长时间冻存。但为了血液患者和整个人类的未来，科研人员会继续寻找保存血管内皮干细胞的方法。

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