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小鼠胚胎干细胞培养的实验步骤

作者:李韵妮 2021-04-30 阅读:698 来源:本站

胚胎干细胞是当受精卵分裂长成胚胎时,里层细胞团(InnerCellMass)的细胞。胚胎干细胞具备全能性,能够自身升级并具备分化为身体全部组织的能力。早在1970年MartinEvans已从小鼠中分离出胚胎干细胞并在体外进行培养取得成功。而人的胚胎干细胞的体外培养直至近些年才取得成功。

小鼠胚胎干细胞培养的实验步骤

小鼠胚胎干细胞一般培养的实验步骤

1.保持小鼠胚胎干细胞处于未分化情况

小鼠胚胎干细胞细胞培养用含有LIF(败血症抑止因子)和Feed细胞的培养基(高糖高热量)来阻拦细胞的分化。为细胞出示包被有0.1%明胶的平板电脑做为粘附细胞的栽培基质。提议每2-三天从做到80%-90%结合的平板电脑按1:8的比例传代细胞一次,细胞传代之后,在将细胞打疫苗在0.1%明胶包被的培养皿以前,根据事先将细胞打疫苗在沒有历经包被的组织培养板两个钟头,使分化细胞粘附,进而将分化和未分化细胞分开。将细胞全过程放置37℃,5%CO2,100%环境湿度标准下培养。假如在Feed细胞,那么就必须采用MMC进行处理,抑止Feed细胞增殖,但依然能保持其分泌LIF因子的活性。暂不谈及Feed细胞。Feed细胞能够来自STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。

2.提前准备培养基

配置一20×没有DMEM,HS,LIF的溶液散装在50ml离心管中,(稀释为2×,每管42ml),存储在-20℃。根据将21ml该溶液,HS和LIF添加450mlDMEM中制取培养基,0.22μm滤纸过滤。存储于4℃,时间不要超出2周。

3.复苏细胞

细胞被冻存有10%二甲基亚砜(DMSO)中避免 结晶体的产生,结晶体的产生会危害细胞。殊不知,二甲基亚砜对细胞有毒性,迅速的进行细胞复苏是很重要的。将冻存管放置37℃水浴中2分鐘(或放进管中溶液正好彻底溶解),再将细胞转移到一15mlFalcon管中;添加5mlES培养基(用培养基清洗冻存管);离心3分钟;弃上清液,用2mlES培养基重悬细胞,最少吹打10次;打疫苗在明胶包被的6孔或6cm组织培养皿;孵育。

4.冻存细胞

1×PBS洗细胞并留少量PBS在培养皿内;用细胞刮板搜集细胞;将细胞转到15ml离心管管中并离心3分钟;弃去上清并将细胞重悬在冷的冻存液中(10厘米的培养皿用2ml,15厘米的培养皿用6-4ml。)散装于冻存管内,每管1ml;置-80℃隔夜,第二天移入液态氮。

5.明胶包被

将0.5g明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中(50-65℃水浴15~30分钟)。在溶液沒有制冷的状况下根据0.22μm滤纸过滤,存储在4℃。猪呢比包被培养板或培养皿,添加一定量的明胶溶液覆盖培养平面图(15厘米培养皿加2ml,10厘米培养皿加0.5~1ml,溶液的量并不重要,只需能彻底覆盖培养表面就可以了。置室温30分钟;除去明胶溶液,将培养板存储在包装袋中室温放置,最好是将板子放置或倒扣,以防明胶污染盖子和排出培养板。

6.细胞传代

提议每2天传代细胞一次,过度生长的细胞会降低细胞的自然分化率,大家创建了一种纯化方式来除去分化细胞,在将细胞打疫苗在明胶包被的培养板上以前,根据将分化细胞粘附在沒有包被的组织培养板上除去分化细胞。假如添加培养基的量偏少会较为容易将细胞团弄散分开。胚胎干细胞有集聚结团的趋向,传代全过程中细心将细胞弄散分开很重要。那样很有可能会降低细胞的自然分化。将细胞打疫苗在沒有包被的组织培养皿中放进温箱2钟头,分化细胞在该时间内将粘附,而胚胎干细胞仍将保持悬浮;将含有细胞的培养基转到geltin包被的组织培养皿。吹打以确保细胞被分散开保持细胞的传代比例很重要,1:8的比例是好的,能够使细胞的自然分化降到最低。

胚胎干细胞的发现尽管最先来源于对动物的科学研究,可是1998年在小鼠胚胎干细胞创建2017年以后,威斯康星大学的勒布朗詹姆斯-汤姆森专家教授初次发布了创建人胚胎干细胞系的毕业论文。制取胚胎干细胞必须运用人的早期胚胎,他们的制取与试管婴儿技术性的发展趋势息息相关。试管婴儿是用以医治不孕症的方式之一,在这个全过程中,一般 会制取数十个胚胎,从这当中选择2〜3个植入母体,剩下的胚胎能够低温存储以便后用或是丢掉,还可以用以科研,也因此备受争议,因此 要彻底运用胚胎干细胞,人们还有很长的路要走。

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